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凝胶层析法分离蛋白质-【新闻】合金铸件

发布时间:2021-04-20 11:58:51 阅读: 来源:冲压模厂家

凝胶层析法分离蛋白质

一.原理

所谓

层析,就是利用样品中各组成成分的理化性质的差异,使各组分以不同程度分布在

固定相和

流动相两相中,由于各组分随流动相前进的速率不同,从而把它们

分离开来的技术。这些物理特性包括分子的大小、形状、所带电荷、挥发性、溶解性及吸附性质等。层析系统的必要组分有:

a. 固定相,可以是一种固体、

凝胶或固定化的液体

b. 层析床,把固定相填入一个玻璃或金属柱中,或者薄薄涂布一层于玻璃或塑料片上或者吸附在醋酸纤维纸上。

c. 流动相,起溶剂作用的液体或气体

d. 运送系统,用来促使流动相通过层析床。

e. 检测系统,用于检测试管中的物质。

由于不同物质固定相相互作用的强弱不同,从而使得分离目的得以实现。

要点:层析系统中,与固定相作用强的物质受到的阻力最大,而作用弱的物质受到的阻力很小,因而不同物质在层析过程中的迁移距离和洗脱时间不同。

介绍凝胶层析的概念。凝胶层析又称分子筛层析,主要根据混合物中分子的大小和形状不同 ,在通过凝胶时,分子的扩散速率各异而达到分离的目的。凝胶颗粒具有多孔性网状结构,小分子易进入凝胶网孔,流程长而移动速度慢,而大分子物质不能进入凝胶网孔,沿凝胶颗粒间隙流动,流程短移动快。这种现象称为分子筛效应。

在凝胶层析中常用的凝胶有葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。葡聚糖凝胶是由细菌葡聚糖在糖的长链间用交联剂2-氯-2,3-环氧丙烷交联而成。在合成时,调节葡聚糖和交联剂的比例,可以获得具有网孔大小不同的凝胶。G值表示交联度,G值愈大,交联度愈小,网孔和吸水量越大。

本实验通过SephadexG52层析柱,以蒸馏水为洗脱剂,分离血红蛋白与硫酸铜的混合物,从颜色的不同可观察到血红蛋白洗脱快,硫酸铜洗脱较慢。

二.材料

2.仪器 层析柱;吸管;玻璃棒;小烧杯;25ml量筒;试管。

2.试剂 Sephadex G-52;抗凝血; 2.9%NaCI溶液;硫酸铜溶液

三.方法

凝胶的准备。由准备室制备。

样品制备

2.血红蛋白溶液的制备 取抗凝血液约2.5ml于离心管中,离心5分钟,弃去上层血浆,用2.9%NaCI溶液3ml洗血细胞二次,将血细胞用2.5ml蒸馏水稀释,即为Hb稀释液,备用。

3.取Hb稀释液与CuSO4溶液各2.5ml,充分混匀,此混合液作为样品。

装柱 取层析柱一支,将层析柱烧结板下端的死区用蒸馏水充满,不得留有气泡,然后关闭层析柱的出口。将已溶胀的凝胶悬液沿玻棒小心地徐徐灌入柱中,待底部凝胶沉积2-2cm时,再打开出口,继续加入凝胶悬液至凝胶层积集至约25cm高度即可。凝胶悬液尽量一次加完,以免出现不均匀或分层的凝胶带。如表层凝胶凸凹不平时,可用玻棒轻轻搅动,让凝胶自然沉降,使表面平整。

加样与洗脱:加样时先将柱的出口打开,让蒸馏水逐渐流出,待床面上只留下极薄的一层蒸馏水时,关闭出口。用滴管将样品 小心地加到凝胶床的表面上。注意加样时不要将床面冲起,亦不要沿柱壁加入。然后,打开出口,使样品恰好进入床面,用上法滴加2-2倍样品体积的蒸馏水,待完全流进床内后,再加蒸馏水进行扩展洗脱,直至两条区带分开为止。

注意事项:洗脱的过程中,应不断滴加蒸馏水,使始终凝胶床的上表面保留约2cm左右的蒸馏水

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煤气化

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